真核生物的基因组DNA包裹在染色质中，因此真核DNA复制发生在染色质环境下。染色质的基本结构单位是核小体，由147 bp DNA缠绕的组蛋白八聚体组成，组蛋白多种翻译后修饰是表观遗传信息的承载基础。DNA复制时染色质打开然后重新建立，使得DNA复制和染色质复制的偶联，在此过程中亲本染色质携带的表观遗传信息被分配到新合成的子链DNA，因此染色质重建也是表观遗传信息继承的基础，维持基因组和表观基因组稳定。染色质重建的起始步骤是DNA复制偶联的核小体组装，同时也是表观遗传信息继承的关键一环，其核心是DNA合成和核小体组装的偶联。

碱基配对形成了双螺旋结构的DNA，两条链的互补性决定了DNA是以半保留的方式进行复制。组成DNA的两条链是反向平行的，因此解螺旋的DNA的两条单链具有方向，一条是5’-3’，另一条链是3’-5’，但是DNA聚合酶都是5’-3’方向进行合成的，导致复制叉上两条链的合成方向相反。由此DNA复制的一条链是向复制叉前进的方向连续合成，称之为前导链，而另一条链的合成方向和复制叉前进的方向相反，先合成小片段DNA然后连接成完整的DNA分子，这个机制是冈崎夫妇发现的，所以这些短片段称之为冈崎片段，这条链称之为滞后链。滞后链冈崎片段合成先是Pol α合成带有一段RNA的DNA引物，然后发生聚合酶Pol α到 Pol δ的转换，Pol δ继续合成冈崎片段。其间Pol δ通过链置换反应入侵前一个冈崎片段，将含有RNA的保真度较低引物置换，形成单链翘起，进而招募Fen1等核酸酶进行切除被置换的单链DNA，产生的缺口被DNA连接酶（酵母中是Cdc9）连接，保障冈崎片段成熟，形成完整连续的滞后链DNA。伴随冈崎片段合成，核小体也会迅速组装，以免DNA暴露。前期Whitehouse和Smith的研究表明，真核生物的冈崎片段大小与核小体DNA和连接DNA的长度相当，且连接位置在核小体近中轴区，提出滞后链上核小体可以阻碍Pol δ的行进决定冈崎片段的长度ADDIN EN.CITEADDIN EN.CITE.DATA(1, 2)。由于没有直接证据，核小体组装和冈崎片段成熟过程的协同机制尚不明确，李晴课题组发展了电镜核酸技术，对此机制进行了解析。

2024年8月9日，金沙威尼斯欢乐娱人城、北大-清华生命科学联合中心李晴课题组在Science Advances发表题为“DNA polymerase δ subunit Pol32 binds histone H3-H4 and couples nucleosome assembly with Okazaki fragment processing”的研究论文，巧妙利用DNA连接酶降解体系，应用电镜核酸技术观察酵母细胞中DNA复制叉中间体结构，发现核小体中组蛋白和DNA的相互作用决定了链置换的位置，而且DNA聚合酶δ的Pol32亚基在C端有一个组蛋白H3-H4的结合区域，可以直接贡献于后随链上的核小体组装，揭示了后随链上DNA合成和核小体组装的协同机制。

研究者在芽殖酵母中利用AID（Auxin-induced degradation）系统诱导Cdc9在DNA复制早期快速降解，抑制冈崎片段末端的连接，进而在透射电镜下观察DNA复制中间体，发现在超过94%的复制叉上都含有翘起的DNA结构（flap structure），并且这个翘起结构主要集中在其中一条子链上，进一步的分析表明有翘起发生在滞后链(图1)。通过测量翘起结构(Flap)的两个主要特征(图2)：Flap本身的长度和相邻Flap的间距，研究者发现，1)在野生型背景下，Flap的长度集中分布在52 nt左右，其长度受到Pol δ的链置换活性和Fen1的核酸酶活性调控，而且Flap的长度分布具有13-15 nt的步长，可能是由核小体中周期性组蛋白和DNA相互作用障碍链置换合成造成的。2）相邻Flap的间距与冈崎片段长度相似，集中在190 bp左右。该间距的增大来自于DNA复制偶联的核小体组装突变，例如经典组蛋白分子伴侣CAF-1大亚基Cac1的缺失突变（cac1D）以及Mcm2结合组蛋白突变mcm2-3A，两个突变分别会导致新合成组蛋白的组装缺陷和旧组蛋白回收缺陷，这个间距增加到280bp左
右，表明冈崎片段的合成受核小体组装程度调节。

图1： 电镜核酸技术观察DNA连接酶降解后的复制叉结构。图示复制泡结构；左图是Cdc9降解后，右图是未降解对照。

研究者在Pol δ亚基非催化亚基Pol32缺失突变中观察到flap间距变大，和上述提到核小体组装突变cac1D以及mcm2-3A的间距变化类似 (图2)。研究者进一步通过体内、体外分析直接证明了Pol32的C端可以直接结合组蛋白H3-H4，并通过ReIN-Map方法证明Pol32调节滞后链上的核小体组装。

图2：翘起结构 (Flap)的两个特征：Flap的长度 (A)和相邻Flap的间距(B)。

综上，李晴课题组应用电镜核酸技术直接观察复制叉滞后链的分子事件，发现Pol32介导了核小体组装，进而提供了冈崎片段合成过程中链置换的终止位置，为冈崎片段成熟和核小体组装协同机制提供直接证据(图3)。

图3：Pol32介导核小体组装与冈崎片段成熟协同机制。(i) Pol δ催化冈崎片段合成；(ii) 冈崎片段合成后，通过Pol32快速组装H3-H4四聚体到新合成的DNA上；(iii) Pol δ侵入先前产生的具有新生核小体的冈崎片段；(iv) 冈崎片段合成的重复循环，形成反应核小体间距的flap间距；在Pol32缺失突变体中，核小体组装水平下降导致核小体屏障的减少，进而导致冈崎片段增长。

金沙威尼斯欢乐娱人城石国君博士、金沙威尼斯欢乐娱人城博士研究生杨超淇、吴佳乐为论文的共同第一作者。金沙威尼斯欢乐娱人城李晴教授和冯建勋副研究员为本文的共同通讯作者。金沙威尼斯欢乐娱人城雷阳博士和胡家志教授为本文的共同作者。感谢金沙威尼斯欢乐娱人城孔道春教授对电镜核酸技术建议，感谢希望城国家医学中心贝克曼研究所沈炳辉教授对本工作的讨论，感谢金沙威尼斯欢乐娱人城电镜平台郝雪梅老师和刘轶群老师的帮助。本研究感谢科技部、国家自然科学基金委、北京市教育委员会、金沙威尼斯欢乐娱人城-清华大学生命科学联合中心和蛋白质与植物基因研究国家重点实验室等资助。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado1739

参考文献：

1.   D. J. Smith, I. Whitehouse, Intrinsic coupling of lagging-strand synthesis to chromatin assembly.Nature483, 434-U480 (2012).

2.   N. C. Koussa, D. J. Smith, Post-replicative nick translation occurs on the lagging strand during prolonged depletion of DNA ligase I in.G3-Genes Genom Genet11(2021).